随着时间的流逝，姉川胜战的效果日益降低。周遭的人逐渐发现，织田家虽然在会战中赢得胜利，但浅井或朝仓并未因此灭亡，同时也看出织田信长为了应付强敌，而在北近江和越前配置了大批的战略武力。
面对这种情势，被赶出畿内的三好三人众，率先有了反应。七月二十一日，他们再度从摄津登陆，在野田、福岛筑起山寨，准备反攻。在一海之隔的四国拥有坚固城池的三好三人众，简直就像惹人厌的苍蝇一般挥之不去。
不过，这个时候比三好更强的敌人——恐怕也是织田信长一生中最强的敌人——终于开始出动了：那就是以摄津大坂的石山为根据地，在全国各地拥有无数大小据点的本愿寺。
受到农民和领导农民的农村武士热烈信奉的本愿寺一向宗，在战国时期拥有强调以农为本的政治性格，它以全国各地的寺院为据点，架构了一个掌控农村武士的独立小王国。其中有像加贺一样，整个地区完全由一向宗徒众所组成的自治组织所统治的地方；或是像纪州的杂贺或伊势长岛一般，只是在当地拥有武力强大的自治体。整体而言，一向宗拥有一种宗教共和国的政治理念，相信来世救赎的末世思想，并且拒绝来自大名的一切控制和压榨。
这和织田信长以独裁君主统一全国、“天下布武”的理想背道而驰。因此从两年前，本愿寺就满怀苦涩地观望着信长的势力逐渐扩充。特别是信长推行的乐市乐座和统一徵收年贡等制度，剥夺了本愿寺和其辖下寺院的收入来源，对他们而言，简直形同无可原宥的暴力镇压。
站在信长的角度来看，本愿寺超越宗教应有的规范，任意扩充世俗的权力，根本就是个欺骗愚民、贪图钱财的邪教。更何况本愿寺的反抗态度日趋强烈，迟早必须发兵加以征讨。
这两大圣俗势力的反目，信长的敌人当然也看在眼里，不管是朝仓、浅井、三好三人众或足利义昭，莫不暗自期待本愿寺能加入反织田大同盟，积极地展开行动。信长所面临的情势之险恶，就像地下全都铺满了接上导火线的地雷般，一触即爆。
织田信长决意要封锁本愿寺。八月二十日，信长从岐阜出发，二十五日进入摄津，二十六日包围三好大军所在的野田、福岛山寨，同时进军至天王寺，分别在天满、森之宫、海老江、川口、神崎、难波等地安排部将固守，摆出包围石山本愿寺的阵势。信长很明显的是想以军事压力封锁本愿寺的行动。
本愿寺深知情势危险，毫不畏惧地展开反击。
九月五日，本愿寺要求纪州的门徒出兵，六日又向各地门徒发出檄文，呼吁众人群起反抗信长。以第十一代宗主显如之名所发出的这份檄文，陈述信长的做法使寺方深受其扰，宣称不反抗织田家的人一律予以逐出宗门。换言之，本愿寺已经决定要和信长力拚到底。
九月十二日半夜，石山本愿寺突然晨钟大作，举兵反抗信长，原来大量纪州门徒所组成的洋枪队早已在事前进入寺内。长达十年的苦战，就此展开。
本愿寺和信长缠斗的时间，比任何大名都长。当朝仓、浅井败亡，足利义昭遭到放逐，武田信玄和上杉谦信分别去世后，只有这个寺院始终不肯屈服。它消耗掉的织田家士兵比任何势力都多，但本身也流了最多的血。
本愿寺的发兵，无庸置疑地鼓舞了所有反织田势力。待在野田、福岛山寨内的三好大军因而硬撑不屈；在姉川溃败的朝仓和浅井，后来竟和他们取得联系，缓缓自近江来到山城。织田信长腹背受敌，面临了毕生最大的危机。
九月二十三日，信长撤离摄津返回京城，翌日又再拔师坂本，意图攻打朝仓、浅井。但朝仓、浅井登上比叡山，采行持久战术。信长以归还领国内的延历寺领地为条件，劝比叡山延历寺投降，但该寺态度坚定，不改支持朝仓、浅井的立场。
在这之间发生了另一起事件：伊势长岛的一向宗徒奉本愿寺的命令，攻打尾张的小木江城。该城乃由信长的弟弟信兴镇守，由于寡不敌众，城被攻陷，信兴被杀。前有朝仓、浅井，后有三好和石山本愿寺，信长分身乏术，只能眼睁睁地坐视弟弟丧命。可见强大的织田军团在群敌环伺的情况下，早已左支右绌了。
进入十一月以后，北越的山野开始降雪，自越前运送兵粮来此转趋困难，织田家才总算见到一线曙光。因为这么一来，朝仓大军便无法长期滞留比叡山了。信长当然不会放过这个机会，或许该说，信长苦候许久的时机终于到来。
十一月二十一日，信长首先和南近江的六角承祯媾和成功。因为六角家担心北岭大雪覆盖之时，织田大军会一举攻来，所以趁此之前赶紧和信长议和。接着十一月三十日，信长将足利义昭请来三井寺说服朝仓、浅井家接受和议，他甚至还说动朝廷，由天皇直接下令他们言和。
朝仓义景、浅井长政眼见积雪太深，无法运送粮秣，决定回应和议，信长也假称“上意难违”，慨然接受。时值十二月十二日。
织田信长终于脱离了第一重窘境，织田家的将领都不禁松了一口气。然而，天下并未就此太平，不能因而松懈，信长本人也压根就没有这种打算。才刚开年，信长立刻着手各个击破敌人。他所展开的第一个行动，便是在元龟二年（一五七一）正月二日，命令镇守横山城的木下藤吉郎封锁姉川——也就是断绝自近江、姉川到琵琶湖畔的朝妻之间的一切水陆交通，阻断京都、大坂地方与北近江、北陆之间人与物的流通。
据说这是为了断绝大坂本愿寺等和朝仓、浅井、加贺门徒间的联系，但其实信长真正的目的，应该是在阻止物资流通，以减少朝仓、浅井家的财源，因此，实为经济上的封锁。
另一个可能的目的，或许是为了避免洋枪这种新式武器落入朝仓、浅井手中。由于姉川会战，与堺并列的另一个洋枪产地：近江国友村，也已纳入了织田家的势力范围。
之后在一月底，信长又命泷川一益攻打伊势长岛，但是没有甚么收获。长岛的门徒宗以愿证寺为中心，将周遭的分寺布建为城寨，并在本愿寺派来的下间盛照等人的指挥下，组成了强大的军队。愿证寺的证意甚至还自称“长岛大人”，摆出一副战国大名的姿态。
织田家最先缴出成绩的是丹羽长秀。二月二十四日，他降服了浅井家的要将矶野员昌，拿下了佐和山城。信长将此城交给长秀，成为连接北前线据点横山城与岐阜、京都间的重要据点，在巩固织田家逐渐拉长的动线上，意义重大。
不过，整体的情势说起来只能算是有进有退。五月间，木下藤吉郎固守的横山城也遭到浅井长政的攻击，之后信长又再度尝试攻打伊势长岛，结果遭到门徒宗的迂回埋伏，柴田胜家负伤、氏家卜全战死，以惨败告终。当然，战败的风声照例又鼓舞了信长的敌手。
眼前织田家所面临的窘境是，若不彻底击溃某个敌人，就无法打开活路。而此时织田信长竟然选择了一个让天下人惊愕的对象，做为他的第一个目标。
元龟二年八月十八日，织田信长突然率兵前往近江，先进入木下秀吉的横山城，然后在余吴、木之本等地四处放火，接着又在二十八日进入丹羽长秀的佐和山城。九月三日则挥兵攻打了南近江的本愿寺派据点金森。
直到这个时候，似乎连友军都不知道信长出马的目的，咸以为他是在赴京的途中。等到九月十二日，信长突然下令攻击比叡山。
一年前，当朝仓、浅井大军登上比叡山时，信长曾遣人送信，表示愿归还领国内的延历寺领地以交换该寺的支持，否则便要“在初诣时将根本中堂三王二十一社烧个精光”。但当时并没有人信以为真。
不管怎么说，自传教大师以来，“叡山”便是镇护国家的大道场，权威无比，连平清盛都不敢冒犯大批进入京都的叡山僧众，而深为所苦。况且开山六百余年来，也造就了无数的名僧，累积了博深的学识，拥有深厚的传统。同时，这个寺院并未像本愿寺一般积极地发动武力攻击，只是提供朝仓、浅井等“信长的敌人”避难的场所。
织田家的武将当然有人表示反对。明智光秀担心攻打如此权威的大寺院，会带来政治上的不良影响；佐久间信盛则强调会失去学问僧这样的贵重资产。可是信长一概充耳不闻，就这么放火把五百余栋社寺堂塔烧得一干二净，并将三千男女僧俗全数斩首，不论出家与否。
据说当明智光秀说明叡山代代相传的佛像有多么珍贵时，信长竟然应道：
“光秀你似乎还不知道，那些东西都只是木头和金属做的。”
信长以激烈的行动来倡导无神论，同时以血和火将他政教分离的政治理念昭告天下。
在另一方面，信长则对朝廷表现出强烈的尊重，他把京畿内外收集来的米借给京内的百姓，并将因此而得到的利息充做朝廷费用的一部分。
以往大名多半都是奉献土地给朝廷，但信长超越了这种农本社会的观念，改为奉献借贷米的利息。这样的做法的确非常符合信长的作风。他的策略是想藉着提升朝廷的权威，以缓和他对诸多旧传统的无情践踏。对信长来说，古老的权威是随时可以用别的东西来取代的。