伯罗奔尼撒战争使希腊诸城邦大伤了元气，与此同时希腊北部一个贫瘠落后、默默无闻的城邦——马其顿却逐渐强大起来。公元前338年，马其顿军队大败希腊联军于喀罗尼亚城下，确立了在全希腊的霸主地位。马其顿的下一个目标，便是东方的波斯及其他文明世界。公元前336年，马其顿王腓力二世遇刺身亡，他的儿子亚历山大登上王位，时年20岁。他决心继承父业，实现其称霸世界的宏愿。
亚历山大（前355—前323年）才智卓绝，勇武过人，13岁时就师从希腊著名学者亚里士多德，接受系统的希腊文化教育。他醉心研究兵法，16岁起随父出征。在著名的喀罗尼亚战役中，18岁的亚历山大任副统帅，指挥左翼主力取得辉煌战果。亚历山大继承王位之后，即着手仿效希腊人的制度，实行政治、军事改革，削弱氏族贵族的势力，加强君主的权力；改革货币，奖励发展工商业；最重要的是军事改革，他创立了包括步兵、骑兵和海军在内的马其顿常备军，将步兵组成密集、纵深的作战队形，号称马其顿方阵，中间是重装步兵，两侧为轻装步兵，每个方阵还配有由贵族子弟组成的重装骑兵，作为方阵的前锋和护翼。亚历山大通过这些改革，使马其顿的军事实力更加强大。亚历山大在进行了充分准备之后，首先出兵，扑灭了马其顿和希腊各地的反叛硝烟，巩固了专制王权，然后便着手实施其父的远征波斯计划，以攫取东方的财富。
公元前334年春，亚历山大率领马其顿和希腊各邦的联军，包括步兵3万人、骑兵5000人和160艘战舰，渡过达达尼尔海峡，向波斯进军。虽然亚历山大所率领的军队规模对于统治西亚和埃及的庞大波斯帝国而言不算庞大，但是当时的波斯帝国已经衰弱，大流士三世昏庸无能，政治腐败，内部矛盾重重。亚历山大以快速的攻势轻易地征服了小亚细亚半岛。公元前333年，亚历山大的军队在伊苏斯大败波斯军队，波斯国王大流士三世落荒而逃，王室眷属被俘，损失步兵、骑兵约10万人，辎重全部丢失。
公元前332年，亚历山大又挥师南下，沿地中海东岸前进，攻占叙利亚，未经一战进入埃及，被埃及祭司宣布为“阿蒙神（埃及太阳神）之子”，他自封为法老。联军在尼罗河口兴建亚历山大城，该城由亚历山大亲自勘查设计，作为继续东征的后方基地。
公元前331年春，亚历山大回师西亚，假道腓尼基向波斯腹地推进，寻波斯军主力决战。10月初，在底格里斯河东岸的高加米拉以西与波斯军主力对阵。亚历山大以不足5万骑兵，将号称百万、且配备战车战象的波斯大军彻底击溃，大流士三世狼狈逃窜，后被其部将谋杀，古波斯帝国及阿契美尼德王朝就此灭亡。随后，马其顿军队征服了波斯的全部领土，一个横跨欧、亚、非三洲的亚历山大帝国建立起来。
公元前327年，亚历山大率军由里海以南地区继续东进，进军中亚，经安息（帕提亚）、阿里亚、德兰古亚那，北上翻越兴都库什山脉，到达巴克特里亚（大夏）和粟特。大军遇到了当地居民的激烈反抗，亚历山大在作战中也数度负伤。为了加强对广大征服地区居民的统治，亚历山大在多处兴建城垣要塞，这些要塞也以亚历山大的名字命名，并留驻守军。公元前325年，亚历山大率军侵入印度，在印度河谷建立了两座亚历山大城，迅速占领了西北印度的广大地区。他还想进一步征服印度的心脏地带，向恒河流域进发。但是由于印度人民的顽强抵抗，加之疟疾的传染，毒蛇的伤害，而且经过多年远途苦战，兵士疲惫不堪。兵士拒绝继续前进，要求回家。亚历山大不得不放弃东进计划，于公元前325年7月将大部队撤出印度。分两路西返，一路在海军将领涅阿霍斯的率领下取海道由伊朗海湾入波斯湾；一路由亚历山大亲自率领，从陆路经卡曼尼亚沙漠而归。公元前324年初，两路大军会师在巴比伦境内的奥皮斯城。由于长途跋涉，亚历山大的部队损伤极大，将近10年的亚历山大远征，终于结束了。
亚历山大在征服的土地上，建立了一个庞大的帝国，其版图西起希腊，东到印度河流域，南临埃及，北及伊朗高原至中亚，首都设在巴比伦。为了笼络人心，亚历山大推行了带有东方特色的统治政策，不仅保留一部分波斯帝国的地方行政机构和官员，而且还吸收了许多亚洲人加入马其顿军队。为了谋求与东方民族的和解，亚历山大还推行所谓的“欧亚联姻”政策，他亲自带头同波斯国王大流士的女儿斯塔提拉结了婚，许多马其顿的将领也都娶了波斯显贵的女儿，同日参加婚礼的多达1万对。
亚历山大的征服野心并没有因为帝国大业的成就而有所减退，他计划侵入阿拉伯与波斯帝国北面的土地，还想再次入侵印度征服罗马、迦太基和地中海西岸地区。但是公元前323年6月，亚历山大死于恶性疟疾，由于死亡的突然降临，亚历山大未明确他的接班人，导致争夺王权的激烈斗争。将领们纷纷自立为王，横跨欧亚非三洲的马其顿王国从此分裂为若干个希腊化的国家。亚历山大庞大的帝国只存在了短短的13年。