正如有医院骑士团的俗称，医疗事业是圣约翰骑士团的招牌。在罗得岛齐整修筑的医院也是仅次于骑士团大团长城堡的雄伟建筑，运营医院的最高负责人不是来自法兰西就是来自普罗旺斯或奥弗涅的骑士馆长，也就是传统上由法兰西人兼任。顺便一提，英吉利骑士馆长兼任骑兵队的最高负责人，意大利骑士馆长兼任舰队的最高负责人，这些都是成规。
阿马尔菲的商人们当初在耶路撒冷建设医院的目的是为到访圣地的朝圣者提供治疗服务，进入十字军时代以后，又加上了另一个目的，即为那些在保卫圣地免遭异教徒侵害的战斗中负伤的战士疗伤，转移到罗得岛以后，尽管原本使这两个目的形成的环境因素都有很大的变化，但也依然持续了下来。
13世纪末西欧基督教势力完全失去巴勒斯坦以来，有一段时间朝圣也曾中断，但不久之后，威尼斯等西欧各国开始策划以朝圣为目的的集体旅行。伊斯兰教徒一方面达到了把基督教徒驱赶到地中海这一目的，另一方面也无法对朝圣者在圣地花的钱无动于衷，双方就此达成了妥协。往返于西欧与巴勒斯坦之间的朝圣船可以安全地将病人就近卸下，且距离巴勒斯坦较近的地点，便是罗得岛。
1489年塞浦路斯岛被威尼斯共和国吞并，此后西欧的船只也必定会在塞浦路斯停靠，但在此前的150年间，罗得岛上的医院对西欧人来说，一直是一个在偏远之地病倒时，能够接受最安全、最高水平医疗的机构。朝圣者当中，包括王公在内，在社会上具有显赫地位的人不在少数，因此对罗得岛的医院及其经营者圣约翰骑士团来说，悉心提高医疗质量和医院环境的舒适度，也是一种足以收回成本的投资。处于伊斯兰教徒统治下的耶路撒冷，虽然被允许设置修道院，但只能用于朝圣者的住宿，难以兼具治病救人的功能。
而且，虽然保卫圣地的意义已经失去，但如果基于保卫基督教徒免受异教徒暴力这一意义的话，骑士团第二信条——为被异教徒伤害的基督教徒疗伤完全保留了下来。
圣约翰骑士团的船只看到伊斯兰的船只就会予以攻击，但目的并不只是杀死或俘虏船员、击沉或没收船只、抢夺船上货物。土耳其的船只使用基督教徒奴隶充当划桨手的情况较为常见，因此骑士团也就有了将这些人从枷锁中解放出来的大义名分。为实现这一大义而倒在疆场的战士，对宗教骑士团圣约翰骑士团来说，就是保卫基督教徒免受异教徒伤害的战士。再说，骑士团的骑士们也有接受充分医疗的权利。
基于这些理由，罗得岛的骑士团医院不仅建筑外观壮丽雄伟，而且用当时的医疗水平来衡量，医疗品质也出类拔萃。据说其水平之高，甚至达到了能与其比肩的只有威尼斯本国医院的程度。
专属的医师团队由两名内科医师、四名外科医师组成，护士由每周必须前往医院义务工作一天的骑士们承担。顶棚高大、空间宽敞的大房间里摆放着大量单人床，最多可以容纳一百人。每张床的周围都可以挂上布帘。患者的随身用品，以及朝圣者携带的大量行李，用不着塞到床下或堆放在床边，因为沿着大房间一边的墙壁，有一大排能用作仓库的小房间。此外，医院还有为患者服务的食堂。每天早晨，在大房间中央的小小礼拜堂，会为患者们举行弥撒。医院另外还有七个单人病房。
无论患者的贫富，治疗一律免费，住在单间也不用交房费。餐饮也全部平等且免费，套餐包括白面包、葡萄酒、肉类、煮蔬菜，就当时的水平而言可谓相当豪华，而且就餐时还可以使用麻织桌布和银制餐具。这些都是过世骑士的遗物，因此桌布和餐具都装饰着西欧屈指可数的名门望族的徽章。此外，二楼还有一个与病房连通的，虽然不大但却可以在南国浓郁的绿荫下享受散步乐趣的庭院。如此，医院因兴旺而必须时常扩建也是理所当然的了。
医院内部严禁赌博，甚至禁止大声喧哗。虽然允许探视，但实际上并没有那么多会给其他患者带来困扰的探视者。朝圣途中病倒在遥远东方岛屿上的人一般没有能立即赶来看望的亲属，因在战斗中负伤而躺在病床上的骑士，也同样没有家人探视。