三月，吴三桂率领辽东明军约四万人及八九万关外汉民陆续进关，暂屯于山海关至滦县、昌黎、乐亭、开平一带。这里需要纠正一种常见的误解：许多史籍都以为山海关属于吴三桂的防区，甚至把吴三桂说成是山海关总兵。其实当时的明山海关总兵是高第，下辖兵员数目约为一万人。吴三桂进关之后即同高第汇合，密切注视形势的变化。
三月十五日，大顺军进抵居庸关，明守将唐通投降。李自成对山海关一带的官军十分重视，他知道吴三桂所统边兵是明朝的一支劲旅，距离北京比较近，又处于大顺军和满洲贵族军队之间，如果不及时解决，将成为一个重大的隐患。至于解决的方式究竟是以武力消灭还是采用政治手段招降，李自成分析了当时的情况，认为以招降比较稳妥。因为自从大顺军进入山西以后，除了宁武总兵周遇吉负隅顽抗落得个兵败身死的下场外，据守各战略要地的明朝统兵将领，如大同姜瓖、宣府王承胤、居庸关唐通等，都望风归附。在这以前投降的总兵还有白广恩、牛成虎、郑嘉栋、左光先、陈永福等。这种先例对吴三桂自然会产生重大影响。其次，吴三桂自己统兵在外，他的父亲吴襄和其他家属却留在北京，为了保住身家产业，决策投降大顺政权也是在情理当中的。另一方面，如果不先从政治上争取就付诸武力，吴三桂势必倒向满洲贵族。因此，李自成命降将唐通率本部兵马、带上犒赏关宁官军的银两、财物，前往山海关招降吴三桂和高第。唐通去后，“遗三桂书，盛夸自成礼贤，啖以父子封侯。”这两个明朝总兵果然立即投降了。由唐道接管了山海关防务，吴三桂则带领部众向京师进发，准备朝见李自成，接受新命。
吴三桂领着兵马于三月二十四日到永平府（府治在卢龙县），“大张告示：本镇率所部朝见新主，所过秋毫无犯，尔民不必惊恐，等语。”一两天之后又行至玉田县。就在这时，吴三桂得到消息，说他在北京的家属受到大顺军的侵犯，政治态度立即发生了变化。关于导致吴三桂叛变的直接原因有两种说法：一种是说他的爱妾陈圆圆被刘宗敏夺去，于是“冲冠一怒为红颜”。另一种说法是刘宗敏在追赃助饷的过程中，逮捕了吴三桂的父亲吴襄，“索饷二十万”。目前因史料不足，尚无法判定孰是孰非，但大顺军触犯了他的家庭，大致是可信的。吴三桂本来是个封建军阀，他的政治态度完全以个人利害为转移。他投降大顺政权，是为了保住既得利益，并希冀在大顺朝革故鼎新之际侪身于新贵行列。当他获悉自己的家庭受到波及时，便误以为李自成的招降是把他骗来北京，将不利于己。其他地方传来的大顺政权对明降官追赃助饷的种种消息也使他不寒而栗。于是，他一怒而去，率部直奔山海关，向镇守关门的唐通部发起突然袭击。由于变生意外，唐通猝不及防，被吴军击败，山海关遂为吴三桂占领。吴三桂的叛变，对于各方面人士来说都是没有预料到的，也是很不得人心的。在一个当事人的诗中有这样的描写：“吴帅旋关日，文武尽辞行。士女争骇窜，农商互震惊。”说明愿意跟着他背叛大顺政权的人寥寥无几。
唐通被击败后，带着残兵驻于关城西北的一片石，派人向北京告急。约四月初十日左右，李自成得到了吴三桂叛变、山海关被占的消息。经过紧急商议之后，他一面批评了刘宗敏，对吴襄进行了抚慰，并且让牛金星代吴襄起草了一封给吴三桂的信，努力做挽回工作；一面决定亲率大军往山海关平叛。
四月十三日晨，李自成、刘宗敏带领大顺军从北京出发，由丞相牛金星和少数大顺军将领统率一万名士卒守备北京。随军带往山海关的有吴襄和崇祯帝的三个儿子，以及在西安、太原俘获的秦王、晋王。这表明李自成希望让吴襄出面消除误传的谣言，以父子之情打动吴三桂。带明太子朱慈烺等一同前去的用意也非常明显，无非是堵塞吴三桂效忠故主的借口。尽管李自成等作了诸多准备，但这一次招降却没有达到目的。吴三桂叛乱后，关宁两镇兵合在一起只有五万人，占据山海关一隅之地，根本无法同大顺军相抗衡。为了逃脱覆灭的命运，吴三桂不顾民族大义，决定卖身投靠满洲贵族。
这时，满洲贵族在关外建立的清廷，已经度过了由于皇太极去世而出现的内部动荡，注意力又集中到如何利用明朝内部的阶级大搏斗实现自己进取中原的宿愿。在大顺军占领北京以前，清廷曾希望联合农民军推翻明王朝，分享胜利成果。这年正月二十七日，清廷派迟起龙等人充当使者，取道蒙古部落地区给大顺政权送来一封信。信的原文如下：
“大清国皇帝致书于西据明地之诸帅：朕与公等，山河远隔，但闻战胜攻取之名，不能悉知称号，故书中不及，幸毋以此而介意也。兹者致书，欲与诸公协谋同力，并取中原。倘混一区宇，富贵共之矣。不知尊意何如耳。惟速驰书使，倾怀以告，是诚至愿也。”
这封信送到大顺军镇守榆林的大将王良智手里时，李自成已经率军东渡黄河向北京进军了。尽管王良智立即奏知了李自成，但李自成对清廷“协谋同力，并取中原”的建议却未予理会。大顺军摧枯拉朽式的进军，使满洲贵族们既为之眼红，也感到极大的不安。他们不仅考虑到一个新兴的、朝气蓬勃的汉族政权代替原来腐朽没落、不堪一击的明王朝之后，自己将无油水可捞；而且一旦大顺政权完成了汉族地区的统一事业之后，必将凭借强大的人力和物力资源，重新解决辽东问题。因此，清廷在摄政王多尔衮等人的策划下，决定乘大顺军立脚未稳之时出兵干涉。
四月初，清廷得到大顺军占领北京、明朝覆亡的消息，便急不可待地大举兴师。《朝鲜李朝实录》中，记载了朝鲜使臣郑太和四月十四日在安州同清朝使节谈话后写的一件紧急报告，其中说：
“……（清使郑命寿）又曰：‘顷日九王闻中国本坐空虚，数日之内，急聚兵马而行。男丁七十以下，十岁以上，无不从军。成败之判，在此一举。’臣问：‘所谓本坐空虚者何事耶？’曰：‘为土贼所陷’云，而更不明言。所谓本坐似指中原皇帝而言矣。”
四月初九日，多尔衮和豫郡王多铎、武英郡王阿济格等，带领满洲、蒙古八旗兵员的三分之二以及全部汉军大举“伐明”。进军路线是采纳汉奸洪承畴的建议，准备由蓟州、密云地区破边墙而入。四月十五日，清军行至翁后，遇上了吴三桂派来的使者副将杨坤和游击郭云龙，告以山海关形势危急，“若及此时促兵来救，当开山海关门以迎大王”。同时面呈书信一封，内称：“王以盖世英雄，值此摧枯拉朽之会，诚难再得之时也。乞念亡国孤臣忠义之言，速选精兵直入中协、西协。三桂自率所部，合兵以抵都门，灭流寇于宫廷，示大义于中国。则我朝之报北朝者岂惟财帛，将裂地以酧，不敢食言。”多尔衮大喜，除留下使者杨坤外，还派妻弟拜然随郭云龙前往山海关探其虚实。同时下令改变行军路线，向山海关兼程进发。在给吴三桂的回信里，多尔衮避而不用“合兵”一词，却趁机向吴三桂进行招降：“今伯若率众来归，必封以故土，晋为藩王。一则国仇得报，一则身家可保，世世子孙，长享富贵，如河山之永也。”吴三桂得到回书后，果然决定投降，并决心驱迫关辽兵同大顺军恶战一场，借以提高自己在满洲贵族面前的地位。
四月二十一日，大顺军到达山海关，吴三桂只留下少数军队和反动乡绅防守关城，把主力已拉到关内石河，摆开阵势。李自成除了把主力用于石河以外，还派出部队进攻山海关的东罗城、西罗城和北翼城，对吴军实行包围。双方昼夜激战，至二十二日晨，吴军已困惫难支，据守北翼城的一支吴军向大顺军投降，吴三桂的全军已面临崩溃之势。清兵于二十一日晚赶到山海关后，屯驻于欢喜岭。此时的多尔衮并不急于参战，他“蓄锐不发”，要等到吴三桂部支持不住、大顺军也疲惫时再一鼓作气夺取胜利；同时，他也要观察一下吴三桂的诚意，以免上汉人的当。二十二日晨，吴三桂感到形势严重，带着属官和乡绅们出关，至欢喜岭上的威远台谒见摄政王，请求清军立即来援。多尔衮谕以“汝等愿为故主复仇，大义可嘉，予领兵来成全其美。先帝时事，在今日不必言，亦不忍言。但昔为敌国，今为一家。我兵巡关，若动人一株草、一颗粒，定以军法处死。汝等分谕大小居民，勿得惊慌。”继之又对吴三桂道：“尔回，可令尔兵以白布系肩为号。不然，同系汉人，以何为辨？恐致误杀。”说完，让吴三桂等先行回去，自己随即下令清军，从南水门、北水门、关中门三路进关。布好阵势后，即向大顺军阵地发动猛烈冲击。大顺军虽然奋勇迎敌，无奈清兵以逸对劳，而且在数量上也占了很大的优势，故不久便败下阵来。清军乘胜追击，大顺军大败，兵员器械损失惨重，大将刘宗敏也负了伤。李自成只好连夜撤退。他们行经永平范家庄时，把吴襄处斩。二十六日回到北京，又杀吴三桂全家三十四口。而吴三桂本人却在山海关战役结束这一天，被清摄政王承制封为平西王。这样，由于吴三桂的背信弃义，大顺军终于被满汉地主阶级联军击败。从此明末农民战争由盛转衰，进入了以抗清为主的新时期。
山海关战役是顺、清之间关键性的一战，它决定着究竟是大顺朝还是清王朝建立对全国的统治。大顺军的失败，除了上面已经提到的因素以外，主要的原因是：李自成等大顺军领导人，在一片凯歌声中滋长了骄傲轻敌的思想，对于随着明王朝的土崩瓦解而必然出现的满洲贵族的武装干涉，缺乏清醒的估计。这首先表现在，大顺军渡河东征时调集的兵员不够。当时，大顺军兵力总数在百万以上，但平定西北地区后派驻各地的军队教量过多，占领山西、河北、山东等地后，又在各战略要地分别驻军，使兵力进一步分散。因而在北京地区集结的军队，用于对付吴三桂等部的明朝官军虽然胜任有余，但要同强大的满洲贵族军队决一雄雌，就显得力量不够了。
其次，在用政治手段招降吴三桂之后，李自成派往山海关镇守的，只是刚刚投降过来的明将唐通所部八千人，没有派出农民军大将率领重兵协防。派到山海关地区的文官兵政府侍郎左懋泰和山海关防御使张若麒，都是大顺军进京以后从明朝官僚中选拔的。这也反映了大顺政权领导集团对辽东军事形势可能出现的新情况估计得很不够。按情理分析，从万历末年以来，辽东军事冲突连绵不断，特别是崇祯年间清兵几次攻入畿辅地区，造成朝野震惊的局面。要说李自成等人对此一无所知或漠然视之，是绝对不可能的。然而，他们的行动却给人一种强烈的印象，似乎在他们心目中明、清之战是“前朝”的事情，自己并没有同清方交恶，完全可以井水不犯河水，各自安心过日子。因此，他们头脑中的辽东问题只是吴三桂等人统率的关宁边兵，吴三桂投降之后东北方面的问题就已经基本解决，关外虎视眈眈的满洲贵族被置之于度外。如果李自成在山海关地区部署了重兵，吴三桂发动叛乱的可能性势必大大减少，即便叛变也不可能轻易地夺得关门重镇。这种麻痹轻敌不能不说是李自成等起义军领导人犯下的一个重大错误。
清廷方面的情况却正好相反。从皇太极到多尔衮等人都一直密切注视着中原地区阶级斗争的演变，并随时根据获得的情报而决定自己的对策。到大顺军以排山倒海之势向北京进军之时，清廷已经认准农民军是自己的真正对手，紧张地筹画出兵干涉了。顺治元年初，范文程在《致摄政诸王启》里明确指出：
“盖以为明劲敌者我国也，抑则流寇也。正如秦失其鹿，楚、汉逐之，虽与明争天下，实与流寇角也。”
到了大顺军攻占北京，明王朝覆亡之后，清廷就在极短的时间里几乎空国而来，“前后兴师未有如今日之大举”，因为多尔衮等人深知，“成败之判，在此一举”。
一方是对迫在眉睫的危险视若无睹，一方是处心积虑以求一逞。在这种情况下，前者的惨败和后者的大获全胜就是必然的了。李自成农民军在山海关战役中用鲜血写下的教训，直到现在仍然值得记取。