在《浪客剑心》这部动漫中，主人公绯村剑心是虚构的，但是在幕末时期却有不少像剑心这样以暗杀为生的人。以暗杀为职业的人在现代称为“职业杀手”，在中国叫作“刺客”，日语则写作“人斬り”。日本历史小说家司马辽太郎认为暗杀是“事先并无任何的暗示或警告而做出的突然的袭击，或是运用计谋来杀害他人的手段”，并评价说“暗杀是令人憎恶的”、“暗杀的人实在没有资格算是人”。
幕末的暗杀有的由幕府发起，有的由志士们发起。幕末由志士们发起的暗杀，最早的就是前面提到的暗杀井伊大老事件。井伊掀起的“安政大狱”株连过众，自己也成了武士们怨恨的对象。1860年3月3日，18名浪人[1]在江户城外斩杀了井伊，幕府的威信也在暗杀事件之后开始急速下降。
后来幕府和天皇联姻，结果却把幕府的恶名蔓延到了朝廷。很多“尊皇攘夷”的志士觉得朝廷不该和受到洋人恐吓便摇尾乞怜的幕府结合，于是以京都为中心发起了“天诛”行动。“天诛”就是代天惩罚，这些人以上苍的名义惩罚那些他们看不入眼的和洋人打交道的日本人。
最早的“天诛”受害者是大臣岛田左近。岛田在“安政大狱”和皇室联姻中都起了推动作用，京都内外志士们早就将他作为不除不快的对象。1862年7月，岛田在情妇的住处遭到萨摩派出的刺客的袭击，伤重而死的岛田被砍下首级，晾在鸭川[2]河边，首级旁还附上“斩奸状”——列出此人之所以被杀的罪状。岛田遭到杀害的过程成为此后“天诛”的模式：锁定要杀害的人，由数名刺客调查并进行跟踪，通常在晚上以极其残忍的方式将其杀害，之后将首级送往车水马龙的交通要道示众，并附上列出其罪名的“斩奸状”。
京都民众因为普遍厌恶外国人，对于幕府擅自开国的行为很反感，所以最初对于志士们采用“天诛”方式杀害幕府的走狗并不特别排斥。可是“天诛”发展到后来越来越极端，凡是提倡开国或是学习西方知识、科技、制度的先进学者都成为“天诛”的对象，京都顿时陷入无政府的恐怖局势。
大体说来，“天诛”行动盛行于1862和1863这两年，与长州在京都的全盛期相当。长州在1863年8月因政变被逐出京都后，幕府派出维持京都治安的见回组、新选组等“官方武士组织”，盛极一时的“天诛”行动也就逐渐遭到镇压而消失。
幕末的暗杀往往不是出于私人恩怨，而是为了集团的政治理念，为了这个理念身为刺客的个人可以义无反顾地付出生命。或许是出于这样的原因，幕末暗杀事件至今仍不时成为历史小说或是电影戏剧的主题。
[1] 浪人：指的是离开户籍地到外地的武士，这种行为也叫作“脱藩”。
[2] 鸭川：位于日本京都的一条有名的河。